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微生物发酵工艺

作者:365平台 发布日期:2020-07-10 01:07



  微生物发酵工艺_自然科学_专业资料。第六章 微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立 6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念(medium) 供微生物生长

  第六章 微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物生产菌种建立 6.4 发酵培养基制备 6.4 发酵培养基制备 ? 概念(medium) 供微生物生长繁殖和合成各种代谢产物所需要 的按一定比例配制的多种营养物质的混合物。 ? 培养基的组成和比例是否恰当,直接影响微生 物的生长、生产和工艺选择、产品质量和 产量。 6.4.1 培养基的成分 碳源 氮源 无机盐 水 生长因子 前体与促进剂 消泡剂 1、碳源(carbon sources) 概念: 构成微生物细胞和代谢产物中碳素的营养物质。 作用: 为正常生理活动和过程提供能量来 源,为细胞物 质和代谢产物的合成提供碳骨架。 碳源种类 糖类:葡萄糖、淀粉、糊精和糖蜜 脂肪:豆油、棉籽油和猪油 醇类:甘油、乙醇、甘露醇、山梨醇、肌醇 蛋白类:蛋白胨、 酵母膏 速效碳源:糖类、有机酸 迟效碳源:酪蛋白水解产生的脂肪酸 2、氮源(nitrogen sources) 概念: 构成微生物细胞和代谢产物中氮素的营养物质。 作用:为生长和代谢主要提供氮素来源。 种类:无机氮源、有机氮源 有机氮源 几乎所有微生物 都能利用有机氮 源 黄豆饼粉、花生饼粉 棉籽饼粉、玉米浆、蛋 白\胨、酵母粉、尿素 无机氮源 氨水、铵盐和硝酸盐等。氨盐比硝酸盐更快被利用。 工业应用:主要氮源或辅助氮源;调节 pH 值 生理酸性物质:代谢后能产生酸性残留物质。 (NH4)2SO4 利用后,产生硫酸 生理碱性物质:代谢后能产生碱性残留物质。 硝酸钠利用后,产生氢氧化钠。 3、无机盐和微量元素 ? 概念:组成生理活性物质或具有生理调节作用矿物质 ? 作用方式:低浓度起促进作用,高浓度起抑制作用。 ? 种类:盐离子 磷、硫、钾、钠、镁、钙,常常添加 铁、锌、铜、钼、钴、锰、氯,一般不加。 4、水 菌体细胞的主要成分。 营养传递的介质。 良好导体,调节细胞生长环境温度。 培养基的主要成分之一。 5、生长因子(growth factor) 概念: 维持微生物生长所必需的微量有机物,不起碳源和 氮源作用。 种类: 维生素、氨基酸、嘌呤或嘧啶及其衍生物、脂肪酸 等。 天然成分中含有:一般无需添加。 营养缺陷型菌株:必需添加。 6、前体(precursor) ? 概念: 加入到发酵培养基中的某些化合物,被直接结合到 目标产物分子中,而自身的结构无多大 的变化。 ? 使用: 添加前体是提高抗生素产量的重要措施。 多次少量流加的工艺。 6、促进剂(accelerant) ?概念: 促进产物生成的物质,但不是营养物,也不是前体 的一类化合物。 ?种类: 氯化物有利于灰黄霉素、金霉素合成。 表面活性剂吐温、清洗剂,脂溶性小分子化合物等, 起诱导作用。 7、消沫剂(defoamingagent) ?概念: 降低泡沫的液膜强度和表面黏度,使泡沫破裂的化 合物。 ?种类:表面活性剂, 低表面张力。 天然动植物油脂类、 高分子化合物 (高碳醇脂肪酸 和酯类、 聚醚类、 硅酮类) 。 ?作用: 消除泡沫,防止逃液和染菌。 6.4.2 培养基种类及其质量控制技术 培养基的种类 按用途:选择性、鉴别性、富营养培养基等 按物理性质:固体,半固体、液体培养基 按化学组成:合成、半合成、天然培养基 按发酵过程中所处位置和作用:斜面或平板固体、 种子、发酵和补料培养基。 1、固体培养基 ? 概念: (solid medium) 细菌和酵母的固体斜面或平板培养基,链霉菌和丝 状真菌的孢子培养基。 ? 制备: 液体培养基添加 1.0-2.0%琼脂粉。 ? 作用: 提供菌体的生长繁殖,形成孢子。 1、固体培养基-要求与质量 控制 ?单细胞培养基: 营养丰富,满足菌体生长迅速,不 能引起变异。 ?孢子培养基:基质浓度较低,无 机盐浓度适量,以利于孢子形成。 营养不宜太丰富,否则不易产生孢 子。 2、种子培养基 ?概念: (seed medium) 供孢子发芽和菌体 生长繁殖,摇瓶和 作用: 种子罐培养基,为液 体。 使种子扩大培养, 增加细胞数目, 生长形成强壮、 健康和高活性的 种子。 2、种子培养基- 要求与质量控制 用速效性、容易被利用的碳、 培养 基成 分必 需完全, 营养 丰富。 氮源和无机盐等物质,但浓度 不宜高。 种子培养基要与发酵培养基相 适应,主要成分接近,不能差 异太大。 缩短 发酵 的延 滞期。 3、发酵培养基 ?概念: (fermentatio n medium) 提供微生物 生长、目标 产物生成的 生产用培养 基。 作用: 不仅要满足 菌体的生长 和繁殖,还 要满足菌体 合成目标产 物,是发酵 生产中 最关 键和最重要 的培养基。 要求 ?营养物质浓度和 粘度适中 ?组成上丰富完整 ?不同菌种和不同 产物,对培养基 的要求差异很大, 组成和配方需要 优化 4、补料培养基(fed medium) ?概念:发酵过程中添加补充的培养基。 ?作用:稳定工艺条件,延长发酵周期,提高目标 产物产量 ?组成:各种必要的营养物质,碳源、氮源、前体 ?制备:按单一成分配制,各自独立控制,或按一 定比例制成复合补料培养基。 5、控制发酵培养基质量 (1)控制水质: 恒定水源和恒定的水质。 地下深层井水,对水质定期化验检查,使用符合要 求的水质配制 各种培养基 措施:检测与控制水质参数 pH、溶解氧、可溶性固体、污染程度、各种矿物, 特别是重金属的种类和含量。 (2)控制培养基原料的质量: 来源与种类的选择 农产副品:因品种、产地、加工、贮存条件不同 而质量差异较大。 化学原料:杂质含量也不相同。 措施:保持稳定的原料来源。 更换原料时,必需再进行一系列试验,确保产量 和质量的控 制和稳定性。 原料的选择试验: 不同碳源、氮源对菌种生长的能力和产物的生产能力 很不相同。 对原料进行试验,选择满 足发酵要求的来源。 注意: ? ? ? ? ? ? 碳氮浓度与配比:适宜 ? ? ? ? ? ? ? ? ? 速效和缓效成分相互配合,发挥综合优势 ? ? ? pH:配制时加入酸碱性物质搭配,甚至使用缓剂。 (3)控制培养基的黏度: 对发酵的影响: ?高黏度的培养基,不易彻底灭菌 ?影响发酵的通气搅拌等物理过程 ?直接 影响菌体对营养的利用 ?目标产物的分离提取造成困难 措施:固体不溶性成分,淀粉、黄豆粉等增加培 养基的黏度,酶水解,降低大分子物质 (4)控制灭菌操作: 高压蒸气灭菌影响培养基的有效成分甚至是活性。 较高温度下长时间灭菌,营养成分会破 坏,甚至产 生有毒物质。 磷酸盐与碳酸钙、镁盐、铵盐也能反应,生成沉淀 或络合物, 降低利用度。 维生素等不耐高温分解破坏、失活。 6.4.3 制药生产用培养基的配制 一般设计原则 设计思路 计算与定量配制 优化 1、培养基设计一般原则 ? 生物学原则: 根据不同微生物营养和反应需 求设计。 营养物质组成: 较丰富,浓度适当。 成分之间比例:恰当,C/N 比适宜,有机和无 机氮 原料之间:不能产生化学反应。适宜的 pH 和渗 透压 ? 工艺原则:不影响通气搅拌、分离精制和废 物处理,过程容易控制。 ? 低成本原则:原料来源方便,质量稳定,质 优价廉。 ? 高效经济原则:满足菌体生长和合 成产物的 需求,最高得率,最小副产物。 2、培养基设计基本思路 ?起始培养基:根据他人的经验和使用。 ?单因素实验:确定最适宜的培养基成分。 ?多因素 实验:各成分之间最佳配比和浓度优化。 ?中试放大试验:摇瓶、小型发酵罐,到中试,最 后放大到生产罐。 ?综合考虑各种因素,产量、纯度、成本等后,确 定一个适宜的生产配 方。 3、理论计算与定量配制 ?微生物生长和生产可用下列表达式表示: 碳源和能源+氮源+其他营养物质→细胞+产 物+CO2+H2O+热量 ?单位细胞生物量所需最小的营养物质: ?单位产量的最小底物浓度: 碳源和氮源进行转化率计算和分析 ?初步计算:参考微生物的化学和元素组成。 ?转化率:单位质量原料生产的产物量或细胞量。 ?理论转化率:根据代谢途径的物料衡算 ?实际转化率:发酵过程中实际测量数值计算。 ?目标:使实际转化率靠近理论转化率。 无法从生化反应原理来推断和计算出最佳培养 基配方 根据生理学和生物化学理论 参照前 人所用的经验培养基 结合菌的特殊生物学和产品特征要求 进行大量细致和周密的试验研究 小结 培养基组成与作用:C、N、无机盐、水、生长因 子、前体与促进剂、消泡剂 培养基制备与质量控制:固体、种子、发酵培养 基 生产用培养基制备:原则、思路、优化 思考题 (1)培养基组成成分有哪些,有何作用? (2)固体培养基、种子培养基、发酵培养基的 组成特点及其如何衔接? (3)如何研制生产用培养基? 第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 制药微生物生产菌种建立 6.4 培养基制备 6.5 灭菌工艺 6.5 灭菌工艺 灭菌方法与原理 培养基灭菌工艺 空气除菌工艺 几个概念 ?杂菌:除生产菌以外的任何微生物。 ?污染:感染杂菌的培养或发酵体系。 ?消毒:杀灭或清除病原微生物,达到无害化程 度,杀灭率 99.9%以上。 ?杀菌:杀灭或清除一切微生物,达到无活微生 物存在的过程,杀灭率 99.9999%以上。 ?灭菌:微生物杀灭率 99.999999%以上。 6.5.1 灭菌方法与原理 1、化学灭菌 2、物理灭菌 1、化学灭菌 用化学物质杀灭微生物的灭菌操作。 ?化学灭菌剂: 氧化剂类等,卤化物类,有机化合物等。 细胞死亡。 ?应用:皮肤表面、器具、实验室和工厂的无菌 区域的台面、地面、墙壁及空 间的灭菌。 ?机理:蛋白质变性,酶失活,破坏细胞膜透性, 2、物理灭菌 各种物理条件如高温、辐射、超声波及过滤等 进行灭菌 ?紫外线等射线:局部空间 ?干热 灭菌:实验室器皿 ?蒸汽灭菌:培养基 效果好,操作方便,广泛使用。 6.5.2 培养基灭菌 1、微生物高温死亡动力学与灭菌的关系 微生物受热死亡过程的一级动力学反应: -dX/dt= kdX 微生物浓度与灭菌时间成正比,浓度越高,灭 菌时间越长。 灭菌时间与比死亡速率之间的关系 kd 与微生物种类、生理状态、灭菌温度有关 以杀死芽孢的温度和时间为指标。 确保彻底 灭菌,实际操作中增加 50%的保险系数。 2、培养基灭菌的操作方式 (1)分批灭菌操作,间歇灭菌,实罐灭菌: 配制好培养基输入发酵罐内,直接蒸汽加热,达到 灭菌要求的温度和压力后维持一段时间,再冷却至 发酵要求的温度。 ?特点:不需其他的附属设备,操作简便,手动。 ?缺点:加热和冷却时 间较长。营养成分损失较多, 罐利用率低。适合小批量生产规模。 分批操作的灭菌过程 ?加热升温: ?维持灭菌温度: 15-30min,121℃; 0.09-0.10 MPa ?冷却降温: 每段对灭 菌的贡献 于取决时间长短。 分批灭菌的操作过程 ?通入蒸汽:空气管、夹套通入蒸汽。 ?加热升温:70℃,取样管、放料管通入蒸汽。 ?维持保温:120℃,罐压 0.1MPa,排气。调节进 汽和排气量,维持 30min。 ?冷却降温:依次关闭排气、进汽阀。罐压低于空 气压力后, 通入无菌空气,夹套通入冷却水降温。 (2)连续灭菌操作 ?高温短时灭菌操作,连消: ?培养基在发酵罐外经过一套灭菌设备连续的加热 灭菌,冷却后送入已灭菌的发酵罐内的工艺过程。 ?加热升温、维持灭菌温度和冷却降温三个阶段由 不同的设备执行:加热器,保温设备, 冷却器。 (2)连续灭菌操作-流程图 培养基与高压蒸汽直接混匀,达到灭菌温度 (130-140℃) (2)连续灭菌-操作过程 ?配料:配料罐,配制培养基。 ?预热罐:定容和预加热。70 -90℃。 ?加热器:培养 基与蒸汽混合, 快速升到 130-140℃。 ?维持罐:维持灭菌时间,5- 7 分钟。 ?冷却管: 培养基经过冷却水 管冷却。40-50℃。 输入灭菌的发酵罐中。 连续灭菌的特点 1)高温快速灭菌工艺,营养成分破坏的少; 2)热能利用合理,易于自动化控制; 3)不适合粘度大或固形物含量高的培养基灭菌; 4)增加了连续灭菌设备及操作环节,增加染菌几率。 5)对压力要求高,一般为 0.45-0.8 MPa。 6.5.3 空气除菌操作工艺 1、发酵对空气的要求 好氧微生物需要氧气供应,通入空气。 连续一定流量的压缩无菌空气。 空气流量:一般 0.1-2.0。 压强:0.2-0.4 MPa。 空气质量:相对湿度小于 70%;比培养温度高 10-30℃;洁净度 100 级,或失败率 10-3。 2、工业制备大量空气的方法 ?加热灭菌:利用空气压缩时所产生的热量除 菌,无菌化程度不高的发酵过程。 ?静电除菌:通过高压电流场,带电粒子被吸 附。 ? 介质过滤:捕集粒子及各种微生物。发酵工 业采用。 3、空气除菌原理 ?空气中附着在尘埃上的微生物大小为 0.5-5um。 ?离心场作用:颗粒及其微生物沉降 ?直接被截留:颗粒惯性碰撞,相互集聚成大颗 粒。气流速度越大,惯性越大,截留效果越好。 ?静电引力:有一定作用。 4、空气过滤介质 ?膜过滤介质:孔径小于被截留微生物体积 硝酸纤维酯、聚四氟乙烯、聚砜、尼龙膜,四氟乙烯、 纤维素树脂微孔滤膜。0.1-0.5um ?深层过滤介质:空隙大于被截留微生物体积。 ?纤维状或颗粒状:棉花(50um)、玻璃纤 维、活性炭 ?过滤纸:超细玻璃纤维纸(1-1.5um) ?金属烧结管:单根或几十根甚至上百根金属微孔滤 管安装在过滤器内。 5、空气灭菌工艺过程 小结 灭菌方法与原理:化学、物理 培养基灭菌:间歇式,连续操作 空气除菌:过滤除菌工艺 思考题 (1)与灭菌相关的几个概念有何不同? (2)比较分析培养基的间歇和连续灭菌工 艺的优缺点及操作要点。 (3)空气过滤灭菌的工艺过程及其主要关 键点是是什么? 第六章微生物发酵制药工艺 6.1 微生物发酵与制药 6.2 微生物生长与生产的关系 6.3 微生物菌种建立 6.4 培养基制备 6.5 灭菌工艺 6.6 培养技术 6.6 发酵培养技术 ?选择合适的培养基;提供适宜的环境条件 ?微生物发酵工艺过程的三个工段: ?种子制备 ?接种 ?发酵培养 6.6.1 种子制备 ?种子的制备: ?种子的逐级扩大培养过程。 ?获得一定数量和质量的纯种过程。 1.孢子制备 ?种子活化:将保存菌种接种在固体培养基上, 在适宜条件下培养,恢复其固有生物特性。 ?放线菌孢子:采用琼脂斜面培养基。 ?霉菌 孢子:大米、小米、玉米、麸皮、麦粒等 天然农产品为培养基。 ?细菌:采用碳源有限而氮源 丰富的配方。 2.生产种子制备 ?摇瓶种子制备:母瓶、子瓶。 ?种子罐种子制备:一级、二级、三级种子。 ?种子罐级数:制备种子需逐级扩大培养的 次数 ?确定种子级数的因素: 1、菌种生长特性及菌体繁殖速度:生长快,少 2、发酵罐的容积:越大,多 3、产物的品种及生产规模:越大,多 4、所选用工艺条件:有利于生长的工艺,少 种子扩大培养罐 发酵类型的定义 ?一级发酵:将孢子或菌丝接入直接发酵罐 ?二级发酵:经过一级种子罐,再到发酵罐; 谷氨酸生产 ?三级发酵:二级种子扩大培养,经过二次种子罐, 再接入发酵罐。青霉素 生产 ?四级发酵:三级种子扩 大培养,经过三级种子罐, 再到发酵罐。链霉素生产菌 接种方式 ?单种法:一只种子罐接种一只发酵罐。 ?双种法:两只种子罐接种一只发酵罐。 ?倒种法:从发酵罐中取出一定量发酵液,接 种到另一个发酵罐。 6.6.2 培养技术 1、固体表面培养技术:Solid surface culture 原始,最早采用。 2、液体深层培养:Liquid submerged culture 主要的发酵培养技术 3、高密度培养 (high cell density culture) ?概念:菌体浓度(干重)至少达到 50g/L 以上 的一种理想培养,发酵工艺目标和方向明 确。 ?优点: 缩小发酵体积 增加表达量 成本低,生产率高。 6.6.3 发酵培养的操作方式 1、分批式操作;间歇式操作;不连续操作 2、流加式操作,补料-分批式操作 3、半连续 式操作,反复分批式或换液培养 4、连续式操作,衡态操作 5、灌流式操作,不断灌注新营养,取出条件培 养基。 1、分批式操作 ?概念:培养液一次性装入发酵罐,一次性接种, 经过一段时间培养,一次性卸出全部培养物。 ?特点:非衡态过程-发酵体系的组成(基质、产 物及细胞浓度)都随发酵时间而变化。 ?缺点:开始时基质浓度很高,到中后期,产物浓 度很高,对发酵不利。 ?辅助时间:清洗罐,装料、灭菌,时间长。 2、流加式操作 ?概念:装入大部分培养液,一次性接种,在培养过 程中连续不断补充新培养基,但不取 出培养液。 ?特点: ?流加能源和碳源物质及氨水等。 ?克服了批式的缺点,使生长和生产保持适宜水平。 ?缺点:整个发酵体积不断增加 3、半连续式操作 ?概念:培养液一起装入发酵罐,一次性接种。间 歇取出部分发酵培养物(带放) ,同时补 充同等数 量的新培养基;然后继续培养,直至发酵结束。 ?特点: 发酵罐内的培养液总体积保持不变 使生长和生产保持适宜水平。 ?缺点:丧失部分前体,丧失部分菌体,非生产菌 突变 4.连续式操作 ?概念:培养液一起装入发酵罐,接种后培养过程 中,不断补充新培养基,同时取出包括培养液和菌 体在内的发酵液,直至发酵结束。 ?特点: 恒定状态的发酵,发酵罐内体积及其物系的 组成将不随时间而变。 培养基连续稳定流加; 产物连续稳定收获; 提高菌体密度;自动化。 ?缺点:时间长,杂菌污染、突变机会增多。 5、灌流(注)式操作 ?概念:培养液一起装入发酵罐,接种后培养过 程中,不断补充新培养基,取出部分符合条件培 养基,菌体仍然滞留罐内。 (与半连续培养不同处) ?特点: 除去有毒害的代谢物 补充营养物质 小结 ?发酵培养的基本过程 ?培养技术:概念与特点 ?操作方式:区别,特点 思考题 (1)如何种子罐级数确定? (2)各种操作方式的异同点,如何选择应用?

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